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Javier Fidalgo, * Pierre-Antoine Deglesne, * Rodrigo Arroyo, * Lilian Sepúlveda, * Evgeniya Ranneva, Philippe Deprez Department of Science, Skin Tech Pharma Group, Castello D'Empúries, Cataluña, España * Estos autores tienen algunas ideas sobre este trabajo Igual Antecedentes de la contribución: El ácido hialurónico (HA) es un polisacárido natural que se utiliza en la producción de rellenos dérmicos con fines estéticos.Dado que tiene una vida media de varios días en los tejidos humanos, los rellenos dérmicos a base de HA se modifican químicamente para extender su vida en el cuerpo.La modificación más común en los rellenos comerciales a base de HA es el uso de 1,4-butanodiol diglicidil éter (BDDE) como agente de reticulación para reticular las cadenas de HA.El BDDE residual o sin reaccionar se considera no tóxico a <2 partes por millón (ppm);por lo tanto, se debe cuantificar el BDDE residual en el relleno dérmico final para garantizar la seguridad del paciente.Materiales y métodos: Este estudio describe la detección y caracterización de un subproducto de la reacción de entrecruzamiento entre BDDE y HA en condiciones alcalinas mediante la combinación de cromatografía líquida y espectrometría de masas (LC-MS).Resultados: Después de diferentes análisis, se encontró que las condiciones alcalinas y la alta temperatura utilizadas para desinfectar el hidrogel de HA-BDDE promovieron la formación de este nuevo subproducto, el compuesto “propilenglicol-like”.El análisis de LC-MS confirmó que el subproducto tiene la misma masa monoisotópica que el BDDE, un tiempo de retención (tR) diferente y un modo de absorbancia UV diferente (λ=200 nm).A diferencia del BDDE, en el análisis LC-MS se observó que, en las mismas condiciones de medición, este subproducto tiene una tasa de detección más alta a 200 nm.Conclusión: Estos resultados indican que no existe epóxido en la estructura de este nuevo compuesto.La discusión está abierta para evaluar el riesgo de este nuevo subproducto que se encuentra en la producción de hidrogel de HA-BDDE (relleno dérmico de HA) con fines comerciales.Palabras clave: ácido hialurónico, relleno dérmico HA, ácido hialurónico reticulado, BDDE, análisis LC-MS, subproducto BDDE.
Los rellenos a base de ácido hialurónico (HA) son los rellenos dérmicos más comunes y populares utilizados con fines cosméticos.1 Este relleno dérmico es un hidrogel, generalmente compuesto por >95 % de agua y 0.5-3 % de HA, lo que les da una estructura similar a un gel.2 HA es un polisacárido y el principal componente de la matriz extracelular de los vertebrados.Uno de los ingredientes.Consiste en (1,4)-ácido glucurónico-β (1,3)-N-acetilglucosamina (GlcNAc) unidades de disacáridos repetitivas conectadas por enlaces glucosídicos.Este patrón de disacáridos es el mismo en todos los organismos.En comparación con algunos rellenos a base de proteínas (como el colágeno), esta propiedad hace que HA sea una molécula altamente biocompatible.Estos rellenos pueden exhibir una especificidad de secuencia de aminoácidos que puede ser reconocida por el sistema inmunitario del paciente.
Cuando se usa como relleno dérmico, la principal limitación de HA es su rápida renovación dentro de los tejidos debido a la presencia de una familia específica de enzimas llamadas hialuronidasas.Hasta el momento, se han descrito varias modificaciones químicas en la estructura de HA para aumentar la vida media de HA en los tejidos.3 La mayoría de estas modificaciones intentan reducir el acceso de la hialuronidasa a los polímeros de polisacáridos mediante el entrecruzamiento de las cadenas de HA.Por lo tanto, debido a la formación de puentes y los enlaces covalentes intermoleculares entre la estructura de HA y el agente de reticulación, el hidrogel de HA reticulado produce más productos de degradación antienzima que el HA natural.4-6
Hasta ahora, los agentes químicos de reticulación utilizados para producir HA reticulado incluyen metacrilamida, 7 hidrazida, 8 carbodiimida, 9 divinil sulfona, 1,4-butanodiol diglicidil éter (BDDE) y poli(etilenglicol) diglicidil éter.10,11 El BDDE es actualmente el agente de entrecruzamiento más utilizado.Aunque estos tipos de hidrogeles han demostrado ser seguros durante décadas, los agentes de entrecruzamiento utilizados son reactivos que pueden ser citotóxicos y, en algunos casos, mutagénicos.12 Por lo tanto, su contenido residual en el hidrogel final debe ser alto.El BDDE se considera seguro cuando la concentración residual es inferior a 2 partes por millón (ppm).4
Hay varios métodos para detectar la concentración de BDDE de bajo residuo, el grado de reticulación y la posición de sustitución en los hidrogeles de HA, como la cromatografía de gases, la cromatografía de exclusión por tamaño acoplada con espectrometría de masas (MS), métodos de medición de fluorescencia por resonancia magnética nuclear (RMN) y Cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) acoplada con matriz de diodos.13-17 Este estudio describe la detección y caracterización de un subproducto en el hidrogel de HA reticulado final producido por la reacción de BDDE y HA en condiciones alcalinas.HPLC y cromatografía líquida-espectrometría de masas (análisis LC-MS).Dado que se desconoce la toxicidad de este subproducto del BDDE, recomendamos que la cuantificación de sus residuos se determine de manera similar al método que se suele realizar con el BDDE en el producto final.
La sal de sodio de HA obtenida (Shiseido Co., Ltd., Tokio, Japón) tiene un peso molecular de ~1.368.000 Da (método de Laurent) 18 y una viscosidad intrínseca de 2,20 m3/kg.Para la reacción de reticulación, se adquirió BDDE (≥95%) de Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO, EE. UU.).La solución salina tamponada con fosfato con pH 7,4 se adquirió de Sigma-Aldrich Company.Todos los disolventes, acetonitrilo y agua utilizados en el análisis LC-MS se adquirieron de calidad de grado HPLC.El ácido fórmico (98%) se compra como grado reactivo.
Todos los experimentos se realizaron en un sistema UPLC Acquity (Waters, Milford, MA, EE. UU.) y se conectaron a un espectrómetro de masas de triple cuadrupolo API 3000 equipado con una fuente de ionización por electropulverización (AB SCIEX, Framingham, MA, EE. UU.).
La síntesis de hidrogeles de HA reticulados se inició añadiendo 198 mg de BDDE a una solución de hialuronato de sodio (NaHA) al 10 % (p/p) en presencia de álcali al 1 % (hidróxido de sodio, NaOH).La concentración final de BDDE en la mezcla de reacción fue de 9,9 mg/ml (0,049 mM).Luego, la mezcla de reacción se mezcló completamente y se homogeneizó y se dejó proceder a 45°C durante 4 horas.19 El pH de la reacción se mantiene en ~12.
A continuación, la mezcla de reacción se lavó con agua y el hidrogel de HA-BDDE final se filtró y diluyó con tampón PBS para lograr una concentración de HA de 10 a 25 mg/ml y un pH final de 7,4.Para esterilizar los hidrogeles de HA reticulados producidos, todos estos hidrogeles se esterilizan en autoclave (120°C durante 20 minutos).El hidrogel de BDDE-HA purificado se almacena a 4°C hasta su análisis.
Para analizar el BDDE presente en el producto de HA reticulado, se pesó una muestra de 240 mg y se introdujo en el orificio central (Microcon®; Merck Millipore, Billerica, MA, EE. UU.; volumen 0,5 mL) y se centrifugó a 10.000 rpm a temperatura ambiente. 10 minutos.Se recolectó y analizó un total de 20 µL de líquido desplegable.
Para analizar el estándar BDDE (Sigma-Aldrich Co) en condiciones alcalinas (1%, 0,1% y 0,01% NaOH), si se cumplen las siguientes condiciones, la muestra líquida es 1:10, 1:100 o hasta 1:1,000,000 Si es necesario, use agua desionizada MilliQ para el análisis.
Para los materiales de partida utilizados en la reacción de entrecruzamiento (HA al 2 %, H2O, NaOH al 1 % y BDDE 0,049 mM), se analizó 1 ml de cada muestra preparada a partir de estos materiales utilizando las mismas condiciones de análisis.
Para determinar la especificidad de los picos que aparecen en el mapa de iones, se agregaron 10 µL de solución estándar de BDDE de 100 ppb (Sigma-Aldrich Co) a la muestra de 20 µL.En este caso, la concentración final del estándar en cada muestra es de 37 ppb.
Primero, prepare una solución madre de BDDE con una concentración de 11 000 mg/L (11 000 ppm) diluyendo 10 μL de BDDE estándar (Sigma-Aldrich Co) con 990 μL de agua MilliQ (densidad 1,1 g/mL).Utilice esta solución para preparar una solución de BDDE de 110 µg/L (110 ppb) como dilución estándar intermedia.Luego, use el diluyente estándar de BDDE intermedio (110 ppb) para preparar la curva estándar diluyendo el diluyente intermedio varias veces para lograr la concentración deseada de 75, 50, 25, 10 y 1 ppb.Como se muestra en la Figura 1, se encuentra que la curva estándar de BDDE de 1.1 a 110 ppb tiene buena linealidad (R2>0.99).La curva estándar se repitió en cuatro experimentos independientes.
Figura 1 Curva de calibración estándar de BDDE obtenida por análisis LC-MS, en la que se observa una buena correlación (R2>0.99).
Abreviaturas: BDDE, 1,4-butanodiol diglicidil éter;LC-MS, cromatografía líquida y espectrometría de masas.
Para identificar y cuantificar los estándares de BDDE presentes en el HA reticulado y los estándares de BDDE en la solución base, se utilizó el análisis LC-MS.
La separación cromatográfica se logró en una columna LUNA 2,5 µm C18(2)-HST (50×2,0 mm2; Phenomenex, Torrance, CA, EE. UU.) y se mantuvo a temperatura ambiente (25 °C) durante el análisis.La fase móvil consta de acetonitrilo (disolvente A) y agua (disolvente B) que contiene un 0,1 % de ácido fórmico.La fase móvil se eluye mediante elución en gradiente.El gradiente es el siguiente: 0 minutos, 2% A;1 minuto, 2% A;6 minutos, 98% A;7 minutos, 98% A;7,1 minutos, 2% A;10 minutos, 2% A. El tiempo de funcionamiento es de 10 minutos y el volumen de inyección es de 20 µL.El tiempo de retención de BDDE es de aproximadamente 3,48 minutos (variando de 3,43 a 4,14 minutos según los experimentos).La fase móvil se bombeó a un caudal de 0,25 ml/min para el análisis LC-MS.
Para el análisis y cuantificación de BDDE por MS, el sistema UPLC (Waters) se combina con un espectrómetro de masas API 3000 triple cuadrupolo (AB SCIEX) equipado con una fuente de ionización por electrospray, y el análisis se realiza en modo de iones positivos (ESI+).
De acuerdo con el análisis de fragmentos de iones realizado en BDDE, se determinó que el fragmento con mayor intensidad era el fragmento correspondiente a 129.1 Da (Figura 6).Por lo tanto, en el modo de monitoreo de iones múltiples (MIM) para la cuantificación, la conversión de masa (relación masa-carga [m/z]) de BDDE es 203,3/129,1 Da.También utiliza el modo de escaneo completo (FS) y el modo de escaneo de iones de producto (PIS) para el análisis LC-MS.
Para verificar la especificidad del método, se analizó una muestra en blanco (fase móvil inicial).No se detectó señal en la muestra en blanco con una conversión de masa de 203,3/129,1 Da.Con respecto a la repetibilidad del experimento, se analizaron 10 inyecciones estándar de 55 ppb (en el medio de la curva de calibración), lo que resultó en una desviación estándar residual (RSD) <5% (datos no mostrados).
El contenido residual de BDDE se cuantificó en ocho hidrogeles diferentes de HA reticulado con BDDE esterilizados en autoclave, correspondientes a cuatro experimentos independientes.Como se describe en la sección "Materiales y métodos", la cuantificación se evalúa por el valor promedio de la curva de regresión de la dilución estándar de BDDE, que corresponde al pico único detectado en la transición de masa de BDDE de 203,3/129,1 Da, con una retención tiempo de 3,43 a 4,14 minutos Sin esperar.La Figura 2 muestra un cromatograma de ejemplo del estándar de referencia BDDE de 10 ppb.La Tabla 1 resume el contenido de BDDE residual de ocho hidrogeles diferentes.El rango de valores es de 1 a 2,46 ppb.Por lo tanto, la concentración residual de BDDE en la muestra es aceptable para uso humano (<2 ppm).
Figura 2 Cromatograma iónico del estándar de referencia BDDE de 10 ppb (Sigma-Aldrich Co), transición MS (m/z) obtenida por análisis LC-MS de 203,30/129,10 Da (en modo MRM positivo).
Abreviaturas: BDDE, 1,4-butanodiol diglicidil éter;LC-MS, cromatografía líquida y espectrometría de masas;MRM, monitorización de reacciones múltiples;EM, masa;m/z, relación masa-carga.
Nota: Las muestras 1-8 son hidrogeles de HA reticulado con BDDE esterilizados en autoclave.También se informan la cantidad residual de BDDE en el hidrogel y el tiempo máximo de retención de BDDE.Finalmente, también se reporta la existencia de nuevos picos con diferentes tiempos de retención.
Abreviaturas: BDDE, 1,4-butanodiol diglicidil éter;HA, ácido hialurónico;MRM, monitorización de reacciones múltiples;tR, tiempo de retención;LC-MS, cromatografía líquida y espectrometría de masas;TRR, tiempo de retención relativo.
Sorprendentemente, el análisis del cromatograma de iones LC-MS mostró que, en base a todas las muestras de hidrogel de HA reticulado y esterilizadas en autoclave analizadas, hubo un pico adicional en el tiempo de retención más corto de 2,73 a 3,29 minutos.Por ejemplo, la Figura 3 muestra el cromatograma de iones de una muestra de HA entrecruzado, donde aparece un pico adicional en un tiempo de retención diferente de aproximadamente 2,71 minutos.Se encontró que el tiempo de retención relativo (RRT) observado entre el pico recién observado y el pico de BDDE era 0,79 (Tabla 1).Dado que sabemos que el pico recién observado está menos retenido en la columna C18 utilizada en el análisis LC-MS, el nuevo pico puede corresponder a un compuesto más polar que el BDDE.
Figura 3 Cromatograma de iones de muestra de hidrogel de HA reticulado obtenido por LC-MS (conversión de masa MRM 203,3/129,0 Da).
Abreviaturas: HA, ácido hialurónico;LC-MS, cromatografía líquida y espectrometría de masas;MRM, monitorización de reacciones múltiples;TRR: tiempo de retención relativo;tR, tiempo de retención.
Con el fin de descartar la posibilidad de que los nuevos picos observados puedan ser contaminantes originalmente presentes en las materias primas utilizadas, estas materias primas también se analizaron utilizando el mismo método de análisis LC-MS.Los materiales de partida analizados incluyen agua, NaHA al 2 % en agua, NaOH al 1 % en agua y BDDE a la misma concentración utilizada en la reacción de reticulación.El cromatograma iónico del material de partida utilizado no mostró ningún compuesto ni pico, y su tiempo de retención corresponde al nuevo pico observado.Este hecho descarta la idea de que no solo el material de partida pueda contener algún compuesto o sustancia que pueda interferir con el procedimiento de análisis, sino que no hay indicios de una posible contaminación cruzada con otros productos de laboratorio.Los valores de concentración obtenidos tras el análisis LC-MS de BDDE y nuevos picos se muestran en la Tabla 2 (muestras 1-4) y el cromatograma iónico en la Figura 4.
Nota: Las muestras 1-4 corresponden a las materias primas utilizadas para producir hidrogeles de HA reticulado con BDDE esterilizados en autoclave.Estas muestras no se esterilizaron en autoclave.
Abreviaturas: BDDE, 1,4-butanodiol diglicidil éter;HA, ácido hialurónico;LC-MS, cromatografía líquida y espectrometría de masas;MRM, monitorización de reacciones múltiples.
La Figura 4 corresponde al cromatograma LC-MS de una muestra de la materia prima utilizada en la reacción de entrecruzamiento de HA y BDDE.
Nota: Todos estos se miden a la misma concentración y proporción utilizada para llevar a cabo la reacción de reticulación.Los números de las materias primas analizadas por el cromatograma corresponden a: (1) agua, (2) solución acuosa de HA al 2%, (3) solución acuosa de NaOH al 1%.El análisis de LC-MS se realiza para una conversión de masa de 203,30/129,10 Da (en modo MRM positivo).
Abreviaturas: BDDE, 1,4-butanodiol diglicidil éter;HA, ácido hialurónico;LC-MS, cromatografía líquida y espectrometría de masas;MRM, monitorización de reacciones múltiples.
Se estudiaron las condiciones que llevaron a la formación de nuevos picos.Para estudiar cómo las condiciones de reacción utilizadas para producir el hidrogel de HA entrecruzado afectan la reactividad del agente de entrecruzamiento BDDE, lo que conduce a la formación de nuevos picos (posibles subproductos), se realizaron diferentes mediciones.En estas determinaciones se estudió y analizó el reticulante final de BDDE, que se trató con diferentes concentraciones de NaOH (0%, 1%, 0,1% y 0,01%) en medio acuoso, seguido o no de autoclave.El procedimiento de bacterias para simular las mismas condiciones es el mismo que el método utilizado para producir el hidrogel de HA reticulado.Como se describe en la sección "Materiales y métodos", la transición de masa de la muestra se analizó mediante LC-MS a 203,30/129,10 Da.Se calculan el BDDE y la concentración del nuevo pico, y los resultados se muestran en la Tabla 3. No se detectaron nuevos picos en las muestras que no se esterilizaron en autoclave, independientemente de la presencia de NaOH en la solución (muestras 1-4, Tabla 3).Para las muestras esterilizadas en autoclave, los nuevos picos solo se detectan en presencia de NaOH en la solución, y la formación del pico parece depender de la concentración de NaOH en la solución (muestras 5-8, Tabla 3) (RRT = 0,79).La figura 5 muestra un ejemplo de un cromatograma de iones que muestra dos muestras esterilizadas en autoclave en presencia o ausencia de NAOH.
Abreviaturas: BDDE, 1,4-butanodiol diglicidil éter;LC-MS, cromatografía líquida y espectrometría de masas;MRM, monitorización de reacciones múltiples.
Nota: el cromatograma superior: la muestra se trató con una solución acuosa de NaOH al 0,1 % y se sometió a autoclave (120 °C durante 20 minutos).Cromatograma de fondo: La muestra no se trató con NaOH, sino que se autoclavó en las mismas condiciones.La conversión de masa de 203,30/129,10 Da (en modo MRM positivo) se analizó mediante LC-MS.
Abreviaturas: BDDE, 1,4-butanodiol diglicidil éter;LC-MS, cromatografía líquida y espectrometría de masas;MRM, monitorización de reacciones múltiples.
En todas las muestras esterilizadas en autoclave, con o sin NaOH, la concentración de BDDE se redujo considerablemente (hasta 16,6 veces) (muestras 5-8, Tabla 2).La disminución de la concentración de BDDE puede deberse al hecho de que, a altas temperaturas, el agua puede actuar como base (nucleófilo) para abrir el anillo epóxido de BDDE y formar un compuesto de 1,2-diol.La calidad monoisotópica de este compuesto es diferente a la del BDDE y, por lo tanto, no se verá afectada.LC-MS detectó un cambio de masa de 203,30/129,10 Da.
Finalmente, estos experimentos muestran que la generación de nuevos picos depende de la presencia de BDDE, NAOH y del proceso de autoclave, pero no tiene nada que ver con HA.
El nuevo pico encontrado en un tiempo de retención de aproximadamente 2,71 minutos se caracterizó luego por LC-MS.Para ello, se incubó BDDE (9,9 mg/mL) en una solución acuosa de NaOH al 1% y se sometió a autoclave.En la Tabla 4 se comparan las características del nuevo pico con el pico de referencia de BDDE conocido (tiempo de retención de aproximadamente 3,47 minutos).Con base en el análisis de fragmentación de iones de los dos picos, se puede concluir que el pico con un tiempo de retención de 2,72 minutos muestra los mismos fragmentos que el pico BDDE, pero con diferentes intensidades (Figura 6).Para el pico correspondiente al tiempo de retención (PIS) de 2,72 minutos, se observó un pico más intenso después de la fragmentación a una masa de 147 Da.A la concentración de BDDE (9,9 mg/mL) utilizada en esta determinación, también se observaron diferentes modos de absorbancia (UV, λ=200 nm) en el espectro ultravioleta después de la separación cromatográfica (Figura 7).El pico con un tiempo de retención de 2,71 minutos sigue siendo visible a 200 nm, mientras que el pico de BDDE no se puede observar en el cromatograma en las mismas condiciones.
Tabla 4 Resultados de la caracterización del nuevo pico con un tiempo de retención de aproximadamente 2,71 minutos y el pico de BDDE con un tiempo de retención de 3,47 minutos
Nota: Para obtener estos resultados, se realizaron análisis de LC-MS y HPLC (MRM y PIS) en los dos picos.Para el análisis HPLC, se utiliza detección UV con una longitud de onda de 200 nm.
Abreviaturas: BDDE, 1,4-butanodiol diglicidil éter;HPLC, cromatografía líquida de alta resolución;LC-MS, cromatografía líquida y espectrometría de masas;MRM, monitorización de reacciones múltiples;m/z, relación masa-carga;PIS, barrido de iones producto;luz ultravioleta, luz ultravioleta.
Nota: Los fragmentos de masa se obtienen mediante análisis LC-MS (PIS).Cromatograma superior: espectro de masas de fragmentos de muestra estándar de BDDE.Cromatograma inferior: el espectro de masas del nuevo pico detectado (RRT asociado con el pico BDDE es 0,79).El BDDE se procesó en una solución de NaOH al 1 % y se sometió a autoclave.
Abreviaturas: BDDE, 1,4-butanodiol diglicidil éter;LC-MS, cromatografía líquida y espectrometría de masas;MRM, monitorización de reacciones múltiples;PIS, barrido de iones de producto;TRR, tiempo de retención relativo.
Figura 7 Cromatograma iónico del ión precursor de 203,30 Da, y (A) el nuevo pico con un tiempo de retención de 2,71 minutos y (B) la detección UV del pico estándar de referencia BDDE a los 3,46 minutos a 200 nm.
En todos los hidrogeles de HA reticulados producidos, se observó que la concentración de BDDE residual después de la cuantificación por LC-MS era <2 ppm, pero apareció un nuevo pico desconocido en el análisis.Este nuevo pico no coincide con el producto estándar BDDE.El producto estándar BDDE también se ha sometido al mismo análisis de conversión de calidad (conversión MRM 203,30/129,10 Da) en el modo MRM positivo.Generalmente, otros métodos analíticos, como la cromatografía, se utilizan como pruebas límite para detectar BDDE en hidrogeles, pero el límite máximo de detección (LOD) es ligeramente inferior a 2 ppm.Por otro lado, hasta ahora, la RMN y la EM se han utilizado para caracterizar el grado de entrecruzamiento y/o modificación de HA en los fragmentos de unidades de azúcar de productos de HA entrecruzado.El propósito de estas técnicas nunca ha sido cuantificar la detección de BDDE residual en concentraciones tan bajas como las que describimos en este artículo (LOD de nuestro método LC-MS = 10 ppb).
Hora de publicación: 01-sep-2021